Una notte al museo di Shawn Levy finisce con Larry che finalmente mette al sicuro il suo posto di custode del Museo di Storia naturale. E obbliga i tre custodi a ripulire tutto, dopo il caos della notte precedente. Come ciliegina sulla torta, suo figlio Nick è orgoglioso di presentare suo padre alla classe. Ambientato nel bellissimo sito culturale newyorchese, Una notte al museo è la storia di Larry (Ben Stiller), un uomo mite e un po’ goffo che dopo anni di peregrinazioni trova lavoro come custode del Museo di Storia Naturale.
L’uomo viene assunto al posto dei tre vecchi guardiani perché il budget stabilito dal direttore (Ricky Gervais) si è drasticamente ridotto. I tre, Cecil (Dick Van Dyke), Gus (Mickey Rooeny) e Reginald (Bill Cobbs), danno istruzioni a Larry che subito si rende conto di quanto magico sia quel luogo. Di notte, infatti, tutti i reperti lì conservati, dallo scheletro del Tyrannosaurus Rex alle statue di Theodore Roosewelt (Robin Williams), prende vita.
Proprio il presidente americano spiega a Larry che il miracolo è possibile grazie alla tavola del faraone Ahkmenrah (Rami Malek), l’unico a non poter mai uscire allo scoperto, perché considerato troppo violento. Così, notte dopo notte, e con l’aiuto della guida Rebecca (Carla Gugino), Larry impara tutto il possibile su quelle favolose creature. Al fine di poterle controllare meglio.
Larry spera anche di poter riconquistare la fiducia del figlio Nick, perennemente deluso da lui. Una notte decide di portare Nick con sé nella speranza che il ragazzino possa vedere il museo prendere vita, ma così non è. I tre custodi, infatti, hanno rubato alcuni oggetti, tra cui la famigerata tavola del faraone, per godersi una dorata pensione e far ricadere la colpa su Larry.
Quando la tavola si attiva tutto riprende vita, ma Larry e suo figlio finiscono sotto chiave nella sala egizia, dove trovano Ahkmenrah. Si tratta in realtà di un giovane molto colto e poliglotta che aiuta Larry a organizzare una caccia ai tre uomini in fuga. Una caccia caotica ma vittoriosa che coinvolge tutte le creature del museo. Le quali, alla fine di una notte complicata, tornano al loro posto.
L’indomani è tutto sottosopra e tra pitture rupestri e orme di dinosauro, l’intera città di New York è marchiata dal passaggio degli abitanti del museo. I cittadini, incuriositi, prendono d’assalto il luogo e il direttore, felice di tanto interesse, decide di tenere Larry. Saranno i tre custodi a dover ripulire tutto.
